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The Effect of Natural Extracts on Filaggrin Reproduction in HaCaT cells and AD-like Animal Model

HaCaT 세포주와 아토피 실험동물 모델에서 필라그린 재생을 위한 천연물의 효과

Cha, Kyung Jae (차경재, Graduate School, Eulji University)

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Atopic dermatitis (AD), also known as eczema, is a type of inflammation of the skin. It results in scratchy, red, swollen, and chapped skin. The condition typically starts in childhood with varying severity over the years. Although the exact cause of atopic dermatitis has not been elucidated yet,...
Atopic dermatitis (AD), also known as eczema, is a type of inflammation of the skin. It results in scratchy, red, swollen, and chapped skin. The condition typically starts in childhood with varying severity over the years. Although the exact cause of atopic dermatitis has not been elucidated yet, skin barrier dysfunction, immune system dysregulation, and genetic and environmental factors are known to be associated with an increased risk of atopic dermatitis. Among them, skin barrier protein defects and immune system dysfunction play very important roles in the development of AD. Impaired skin barrier function facilitates penetration of multiple antigens and stimulants into the skin, resulting in a vicious cycle in which inflammation is exacerbated by abnormal production of IgE and various cytokines. For this reason, many researchers are developing reproduction therapies for proteins of the skin using natural substances and various therapeutic agents that inhibit inflammation. However, in relation to the majority of therapies using natural substances, little is known about the mechanisms and development strategies for controlling the clinical characteristics of AD. Therefore, I investigated the effect of filaggrin regeneration and cell signaling pathway on atopic dermatitis using three kinds of natural extracts (such as Patrinia scabiosifolia Link, Chaenomeles sinensis Koehne, Poncirus trifoliata (L.) Raf.). In part 1, I examined the anti-inflammatory effect of Patrinia scabiosifolia Link extract on the development of lesions similar to atopic dermatitis in human keratinocytes and NC/Nga mice. Whole PS plants were dried, powdered, and then underwent extraction with DMSO. Both ELISA and western blotting were performed to evaluate cytokine concentration and the expression and activation of filaggrin and signaling proteins. Five-week‐old female NC/Nga mice were used as an AD-like mouse model by treating them with 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB). As a result, in human keratinocytic HaCaT cells, PS extract inhibited the production of IL‐8, and TARC, which had been increased by TNF-α and IFN-γ. The TNF-α and IFN-γ suppressed filaggrin expression was associated with phosphorylation of JNK, and NF-κB translocation. PS extract recovered the inhibition of filaggrin expression induced by TNF-α and IFN-γ by blocking the activation of JNK, and NF-κB by the TNF- α and IFN-γ treatment. The in vivo experiment results showed that, compared to DNCB treatment PS administration reduced thickening of the epidermis and infiltration of inflammatory cells into the dermis. Moreover, the decrease of filaggrin expression due to DNCB treatment was recovered by PS administration. The serum IgE level was decreased by PS treatment. Additionally, secretions of IL-4, IL-5, IL-13, and eotaxin in splenocytes were lower in the PS-treated group than in the DNCB group. In part 2, the ability of Chaenomeles sinensis Koehne extract was tested in human keratinocyte HaCaT cells in vitro and in atopic dermatitis-like lesion in vivo to study the underlying mechanism of anti-allergic effect of CS extract. Whole CS plants were dried, powdered, and then underwent extraction with DMSO. Both ELISA and western blotting were performed to evaluate cytokine concentration and the expression and activation of filaggrin and JNK. Five-week‐old female NC/Nga mice were used as an AD-like mouse model by treating them with 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB). As a result, the secretion of TARC, MCP-1, IL‐8 and IL-6 is increased by TNF-α and IFN-γ in HaCaT cells, and CS extract significantly inhibited the increased production of TARC, MCP-1, and IL‐8 except for IL-6. TNF-α and IFN-γ suppressed filaggrin expression by activating JNK. CS extract recovered the expression of filaggrin decreased by TNF-α and IFN-γ by blocking the activation of JNK. In vivo experiment, CS administration reduced thickening of the epidermis and infiltration of inflammatory cells into the dermis as compared to DNCB treatment. Moreover, the decrease of filaggrin expression due to DNCB treatment was recovered by CS administration. The serum IgE level was decreased by CS treatment. The levels of IL-4, IL-5, IL-13 and eotaxin in mouse splenocytes increased after treatment with concanavalin A, and the secretions of IL-4, IL-5, IL-13 and eotaxin were lower in the CS-treated group than in the DNCB group. In part 3, Poncirus trifoliata (L.) Raf. extract inhibits the development of atopic dermatitis-like lesions in human keratinocytes and NC/Nga mice. The release of TARC, MCP-1, IL-6 and IL‐8 is increased by TNF-α and IFN-γ in HaCaT cells, and PT extract suppressed the increased production of TARC, MCP-1, IL-6, and IL‐8. PT extract recovered the expression of filaggrin decreased by TNF-α and IFN-γ. In vivo experiment, PT administration decreased the skin severity score, thickening of the epidermis, movement of inflammatory cells into the dermis, and serum IgE level as compared to DNCB treatment. Moreover, the decrease of filaggrin expression induced by DNCB treatment was recovered by PT administration. The levels of IL-4, IL-5, IL-13 and eotaxin in mouse splenocytes increased after treatment with concanavalin A, and the secretions of IL-4, IL-5, IL-13 and eotaxin were lower in the PT-treated group than in the DNCB group. These results may contribute to the development of the natural compound-based drug for the treatment of AD.
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아토피 피부염은 습진으로도 알려져 있으며, 염증성 피부 질환이다. 이 질환은 피부를 가렵게 하고 부어 오르고 갈라지게 만듭니다. 이 상태는 전형적으로 어린 시절부터 여러 해에 걸쳐서 다양하게 나타난다. 아토피 피부염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 피부 장벽의 기능 장애, 면역체계이상, 유전적 요인 및 환경적 요인이 아토피 피부염의 발생과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그 중에서도 피부장벽 단백질의 결함과 면역체계이상은 아토피 피부염 발생에 매우 중요한 역할을 한다. 피부장벽의 기능이 손상되면 여러 항원과 자극물질이...
아토피 피부염은 습진으로도 알려져 있으며, 염증성 피부 질환이다. 이 질환은 피부를 가렵게 하고 부어 오르고 갈라지게 만듭니다. 이 상태는 전형적으로 어린 시절부터 여러 해에 걸쳐서 다양하게 나타난다. 아토피 피부염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 피부 장벽의 기능 장애, 면역체계이상, 유전적 요인 및 환경적 요인이 아토피 피부염의 발생과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그 중에서도 피부장벽 단백질의 결함과 면역체계이상은 아토피 피부염 발생에 매우 중요한 역할을 한다. 피부장벽의 기능이 손상되면 여러 항원과 자극물질이 피부에 침투하게 되고 비정상적으로 IgE가 증가되며 다양한 사이토카인이 생성되어 염증이 악화되는 악순환이 발생한다. 이러한 이유로 많은 연구자들은 천연 물질들을 연구하고 염증을 억제하는 다양한 치료제를 사용하여 피부 단백질을 재생하는 치료법을 개발하고 있다. 그러나 천연물질을 사용하는 AD의 임상적 특성을 통제하기 위한 치료법, 메커니즘 및 개발 전략에 대해서는 잘 알려진 바가 거의 없다. 그래서, 저는 세 종류의 천연 추출물을 이용한 아토피 피부염에 대한 filaggrin의 재생과 세포의 신호전달 경로를 연구했다. 파트1에서는 사람 각질세포주와 NC/Nga 마우스에서 아토피 피부염과 유사한 병변 발생에서 마타리(Patrinia scabiosifolia Lin)의 항염증 효과에 대해 연구했다. 이때 마타리 물질 전체를 건조, 분말화한 후 DMSO로 추출 하였다. 사이토카인 농도, fillagrin , 신호전달 단백질의 발현 및 활성화를 평가하기 위해 ELISA와 웨스턴 블롯팅을 이용하였다. 5주된 암컷 NC/Nga 마우스를 DNCB로 처리한 후에 아토피 피부염과 유사한 마우스 모델로서 사용하였다. 그 결과, 마타리 추출물을 처리한 사람 각질세포에서 TNF-α 와 IFN-γ에 의해 증가 된 IL-8 및 TARC의 생성을 억제 하였다. TNF-α와 IFN-γ 가 억제된 filaggrin 발현은 JNK의 인산화와 NF-κB의 활성화와 연관이 있었다. 마타리 추출물은 TNF-α 및 IFN-γ를 처리 후에 JNK 활성화와 NF-κB의 전좌를 차단함으로써 TNF-α 및 IFN-γ에 의해 유도 된 filaggrin 발현의 억제를 회복시켰다. 생체내 실험결과에 따르면 DNCB 치료와 비교하여 마타리 추출물 투여는 표피의 농축과 염증세포가 진피에 침투하는 것을 감소시켰다. 또한 DNCB 처리 후에 filaggrin발현의 감소는 마타리 추출물 처리로 회복되었다. 혈청 IgE 수치는 마타리 추출물 처리에 의해 감소되었다. 또한, 비장 세포에서 IL-4, IL-5, IL-13 및 eotaxin의 분비량은 마타리 추출물 처리 군에서 DNCB 처리군 보다 낮았다. 파트2에서는 모과(Chaenomeles sinensis Koehn) 추출물을 생체 내 사람 각질세포주인 HaCaT 세포주와 동물실험에서 아토피 피부염과 같은 조건으로 실험하여 모과의 항알레르기 효과와 기전을 연구했다. 전체 모과 식물을 건조, 분말화한 다음에 DMSO로 물질을 추출하였다. 사이토카인 농도, 필라그린, JNK의 발현과 활성화를 평가하기 위해 ELISA 및 웨스턴을 사용하였다. 5주된 암컷 NC/Nga 마우스를 DNCB로 처리하여 아토피 피부염 유사 마우스 모델로서 실험하였다. 그 결과 HaCaT세포주에서 TNF-α와 IFN-γ처리에 의해 TARC, MCP-1, IL-8의 분비가 증가하였고 모과 추출물은 TARC, MCP-1, IL-8의 증가를 억제하였다. TNF-α와 IFN-γ는 JNK를 활성화시킴으로써 filaggrin 발현을 억제하였다. 모과 추출물은 JNK 활성화를 차단함으로써 TNF-α와 IFN-γ에 의해 줄어든 filaggrin의 발현을 회복시켰다. 생체 내 실험에서 모과 추출물 투여는 DNCB 처리와 비교하여 표피와 염증세포의 진피 침윤을 감소시켰다. 또한, DNCB 처리로 인한 filaggrin 발현의 감소는 모과 추출물 처리에 의해 회복되었다. 혈청 IgE 수치는 모과 추출물 처리로 감소하였다. 마우스 비장 세포에서 IL-4, IL-5, IL-13 및 eotaxin의 농도는 concanavalin A 로 처리 후에 증가하였고 IL-4, IL-5, IL-13 및 eotaxin의 분비량은 모과 추출물 처리했을 때 DNCB 처리군 보다 더 낮았다. 파트 3에서는 탱자(Poncirus trifoliata (L.) Ra.)추출물은 각질 형성 세포와 NC/Nga 마우스에서 아토피 피부염의 발생을 억제한다. HaCaT 세포에서 TARC, MCP-1, IL-6 및 IL-8의 분비는 TNF-α 및 IFN-γ처리에 의해서 증가되고 탱자 추출물 처리 후에 TARC, MCP-1, IL-6 및 IL -8을 감소시킵니다. 탱자 추출물은 TNF-α와 IFN-γ에 의해 감소된 filaggrin의 발현을 회복시킨다. 생체 내 실험에서 탱자 추출물 투여는 DNCB 치료와 비교하여 피부 평가 지수, 표피의 두께, 염증 세포의 진피로의 이동 그리고 혈청 IgE를 감소시켰다. 또 DNCB 처리에 의해 유도된 filaggrin 발현의 감소는 탱자 추출물 처리에 의해 회복되었다. 마우스 비장 세포에서 IL-4, IL-5, IL-13 및 eotaxin의 농도는 concanavalin A 처리 후 증가하였고 IL-4, IL-5, IL-13 및 eotaxin 은 탱자 추출물 처리 후에 더 낮았다. 이러한 결과들은 아토피 피부염 치료를 위해 천연 화합물을 이용한 약물의 개발에 기여할 수 있을 것이다.
목차 moremore
Abstract = ⅰ
Table of Contents = ⅵ
List of Figures = ⅷ
...
Abstract = ⅰ
Table of Contents = ⅵ
List of Figures = ⅷ
Abbreviation = xiv
Introduction = 1
Part 1: Inhibitory effect of Patrinia scabiosifolia Link on the development of atopic dermatitis-like lesions in human keratinocytes and NC/Nga mice = 4
1.1. Materials and method = 4
1.2. Results = 12
Part 2: Chaenomeles sinensis Koehne extract suppresses the development of atopic dermatitis-like lesions in human keratinocytes and NC/Nga mice = 43
2.1. Materials and method = 43
2.2. Results = 51
Part 3: Poncirus trifoliata (L.) Raf. extract inhibits the development of atopic dermatitis-like lesions in human keratinocytes and NC/Nga mice = 76
3.1. Materials and method = 76
3.2. Results = 84
Discussion = 109
Conclusion = 117
Reference = 122
국문요지 = 134